检测技术从人工走向自动

　　离子通道是指生物体中专门负责快速、精确地控制离子转运的膜蛋白。离子通道是人类基因组中继蛋白酶和G蛋白耦合受体之后的第三大类信号分子。在复杂的多细胞生物体内，离子通道为细胞或组织间传递动作电位形式的电信号提供了基础。例如在关联细胞间，钙离子通道控制肌肉收缩、脑部神经突触的信息传递、激素分泌、基因表达和细胞分裂等。

　　据估算，有200~300个基因参与编码离子通道的致孔亚单位。因此，离子通道有多种结构类型，包括至少143个电压门控离子通道、21个氯离子通道和71个配基门控离子通道。

　　目前，有大约15%的药物是以离子通道为作用靶点，其中包括心律失常、高血压、心衰、癫痫、哮喘、糖尿病、尿潴留和尿失禁、肠易激惹综合征、帕金森氏病、阿尔兹海默氏症和癌症的治疗药物。在美国FDA批准的近180个以离子通道为作用靶点的药物中，有些药的年销售额达几十亿美元，如治疗高血压的氨氯地平（L型钙通道阻滞剂）和治疗癫痫的加巴喷丁（作用于钙通道辅助亚单位）。

　　值得注意的是，绝大多数以离子通道为作用靶点的药物都是在上世纪九十年代以前偶然被发现的。这是因为以离子通道为作用靶点的药物研发还存在很多困难。例如，大量的人离子通道基因通过装配各种致孔和调控亚单位而产生了更多的成熟的离子通道类型，基因的选择性剪接和翻译后修饰使得离子通道更加多样化。就效能最大且副作用最小的要求而言，药物常常需要作用于相关通道亚类中的某个特定通道。这就必须对大量的离子通道进行筛选，以确定药物作用的靶点，但目前还无法获得可表达多系列离子通道作用靶点的细胞系。

　　对此，目前国外已有几家公司经过努力获得了具有代表性的、哺乳动物异种过度表达单个离子通道的稳定细胞系。这些细胞系可用于在药物研发的早期阶段筛选出化合物库中作用于特定离子通道靶点的先导化合物，从而可降低药物开发的总体成本。

　　检测技术从人工走向自动

　　对于以离子通道为作用靶点的药物研发，另一方面的困难就在于离子通道的功能检测技术。以往，药物对离子通道作用的功能分析需要采用“人工膜片钳”电生理学技术，人工膜片钳电生理学技术是离子通道功能测量的金标准。这种技术利用精密的玻璃吸液管对细胞膜产生高阻抗的封接，吸液管下膜片破裂后即能控制膜电位的电压，测量细胞膜离子通道的电流。虽然利用人工膜片钳技术可以获得高质量的数据，并可探查离子通道复杂的生物物理学情况（如开放、关闭、非激活状态）以及各自与药物的相互作用，但这是相当耗费人力的，且需要由具有很高技能的人员来完成。目前这种技术不仅复杂且价格昂贵，这就极大地限制了药物研制早期阶段中功能性离子通道测定的化合物筛选。基于上述原因，人工膜片钳技术不适合用于药物的早期筛选，但可以在离子通道类药物研制的后期阶段被利用，如对药理学安全性方面的研究。

　　不过，对于某些类型的离子通道，近些年出现的高通量自动检测技术使得这种障碍不复存在，离子通道药物的早期发现和安全性筛选变得轻而易举。

　　过去10年中，自动膜片钳电生理学技术的显著进步使得实验数据的产量在不损失测量精度的前提下，比人工方法提高了15~45倍。商业化的平面阵列膜片钳技术IonWorks HT系统和IonWorksQuattro系统以能够对特定孔的电压进行控制的多孔阵列代替了人工膜片钳的玻璃吸液管。IonWorksQuattro系统在单孔模式下可记录384个细胞（每孔1个细胞）；在群体膜片模式下，可对每孔64个细胞的电流进行平均。虽然还需要中等阻抗（几亿欧姆）的封接和采用以两性霉素B作为离子载体的打孔膜片构型，但是对于离子通道细胞系的筛选及药物对不同通道的活性作用的研究，IonWorksQuattro系统被证明极具价值。

　　与其他自动平面阵列膜片钳技术平台相比，IonWorksQuattro系统特别适合用于测定电压门控离子通道，数据通量相对较高，每天可获得1000多个数据点，且强直性和阶段性药物阻断都可以进行测定。不过，由于IonWorksQuattro系统配备相互分离的电流和液流传输头，无法同时放置于孔中，液流传输与记录间的系统时间延迟，使得该系统不适合用于测定快速脱敏通道或配基门控离子通道。

　　对膜片细胞膜产生更高阻抗封接的仪器可以有效解决这个问题。此类仪器可更好地控制电压，并行离子通道记录和液流传输，对配基门控离子通道和快速脱敏通道进行测定。与人工膜片钳技术相比，虽然此类自动膜片钳技术平台具有高保真记录的能力，但数据通量却比IonWorksQuattro系统低，每天只能产生几百个数据点。

　　与自动膜片钳技术相比，荧光平板读取器（如FLIPR系统）的自动荧光测定技术可对离子通道进行更高数据通量的测定，每天可达1万个数据点。目前，已有可用于检测钙离子、氯离子和铊离子的浓度变化、膜电位和pH值变化的荧光染料。自动荧光测定技术对离子通道功能测定的局限性包括无法控制电压，无法研究状态依赖的药物效应以及反应的毫秒解析，无法避免细胞外钾离子变化导致除极。不过，FLIPR系统对检测诱发钙离子浓度变化的离子通道，如电压门控钙通道和瞬时受体电位通道非常有效。

　　荧光测定技术虽然是一种间接测定离子通道活性的方法，但对于大型的离子通道筛选试验，与电生理学方法相比其具有成本低、数据通量高的优点。应用FLIPR系统的另一个优点是，该技术不是对单个细胞而是对细胞群进行响应，这一特点对机械敏感的离子通道的筛选有利。

　　不难看出，离子通道药物的研发和安全性药理学研究的未来充满光明。高通量自动膜片钳技术平台与人胚胎干细胞技术进展的联合为离子通道药物的发现和安全性药理学创造了机会；人胚胎干细胞为评估脱靶药物效应对人心脏离子通道的作用风险提供了不限量的细胞。此外，在这个“后人基因组序列时代”，以疾病相关的突变或特定患者的多态变量定制离子通道细胞系和胚胎干细胞衍生细胞还存在大量机会。